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1. 樣品質量。所抽取樣品的蛋白含量，蛋白變性是否充分等等，還有，蛋白樣品的PH值是否在7~8之間。這會直接影響到樣品濃縮的效果。此外，蛋白樣品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都會對最終結果的可靠性有影響。 2. 凝膠質量。不連續(xù)SDS-PAGE膠對凝膠的要求較高，分離膠的PH值應在8.8左右，而濃縮膠的PH應在6.8左右，最好不要差過0.5個PH單位，因為這個PH條件是保證電泳液中的甘氨酸不電離的必要條件，也是保證能充分壓縮樣品的前提。因此，制備凝膠的時候所用Tris-HCl緩沖液的PH值是否穩(wěn)定是很重要的。 3. 點樣。樣品盡量不要與電泳液混合，這樣能提高濃縮的效果，因為電泳液PH值為8.3，而樣品為7.5，混合后會影響到樣品的PH值，進而影響濃縮效果。因此，建議點樣最好用長槍頭，或者加樣器，輕輕的將樣品加到孔的底部。 4. 電泳緩沖液。盡量用新鮮配制的。這樣能保證PH值和離子強度的穩(wěn)定。 5. 電壓條件。我們經常用的濃縮時80V，分離時100V比較好，條帶很平。 6. 轉膜。膜的選擇主要從實驗目的和實驗要求來考慮。例如，要做分子量小于20kD的小蛋白，0.45μm的NC膜是不可取的，因為這樣可能會使得蛋白因透過膜孔而造成膜結合的目的蛋白量不確定，從而影響到最終結果的可靠性。而如果所分離的蛋白需要進行測序，則非PVDF膜不可，因為只有PVDF膜才能經受住嚴酷的清洗條件。 7. 抗體雜交與底物顯色。一抗盡量選擇小鼠或者兔來源的單克隆抗體，還有要注意所用的抗體是否能夠識別變性條件下的目標蛋白；二抗一般都是效價很高的，只要室溫下雜交1小時就可以了，適當延長也是可以的。另外，要選擇靈敏度較高的化學反應底物。如超敏型ECL發(fā)光液Enlight-Plus，檢測級別可達pg級，發(fā)光時間長，穩(wěn)定。 |
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2樓2019-01-30 18:27:51
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