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請教：熒光定量PCR相關問題 已有1人參與
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大家小年好！給各位蟲友拜個早年呀，本人年后要做qPCR實驗，老師要求在假期寫好實驗方案，查閱了RT-qPCR相關資料，仍有一些問題不太清楚，希望大家?guī)兔獯鹨幌隆?br />
首先我做這個實驗是為了確定該基因在兩種不同條件下的表達量，所以選擇相對定量的方法，實驗步驟分為提取RNA、反轉錄制備cDNA、以cDNA為模板定量PCR三塊，我的問題是：1 參照基因怎么選擇，好像有GAPDH和actin（我知道的是這兩種），但是這兩個基因存在于我的實驗菌株Sphingomonas sp嗎？如果存在的話我是否需要逐個確定參照基因的表達量是穩(wěn)定的，選出最合適的內參基因 2 反轉錄制備的cDNA是單鏈嗎？是否需要以cDNA為模板合成互補鏈？為什么 3 反轉錄之后獲得的應該是cDNA 池吧，因為RNA有三種啊，在不知道模板序列的情況下怎么設計目標基因的引物？ 4 參照基因的引物怎么設計 5 在測定實驗樣本的目標基因和參照基因的Ct值時，起始RNA的量是否應該一致，做對照樣本的實驗時，RNA的量是否應該與實驗組調整成相同 |
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西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2019-01-30 08:47:40
西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2019-01-30 08:47:40
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1 參照基因怎么選擇，可以參考文獻，百度文獻或者知網 搜索 phingomonas sp（中文名）+定量PCR 有些文獻會給你內參基因的引物序列，直接合成即可。 2 cDNA是雙鏈。 3. 反轉錄獲得的是cDNA池。如果你不知道目標基因的模板序列，只能祈求能在文獻里找，看有沒有人在別的菌種里做過這個目標基因，找到這個其他菌種里基因的序列，在NCBI上比對，看能否找到在 phingomonas sp的這個基因序列，再設計引物了。 5 起始的RNA量最好都調成一致。包括對照樣本和基因樣本。 |
2樓2019-01-29 23:10:50
3樓2019-01-30 10:46:30
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4樓2019-01-30 14:49:14
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junjieshao
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7樓2019-04-27 04:28:04
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8樓2019-04-30 16:05:36
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