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書(shū)畫(huà)江湖新蟲(chóng) (小有名氣)
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如何做好westerner-blot實(shí)驗(yàn)？
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1. 樣品質(zhì)量。所抽取樣品的蛋白含量，蛋白變性是否充分等等，還有，蛋白樣品的PH值是否在7~8之間。這會(huì)直接影響到樣品濃縮的效果。此外，蛋白樣品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都會(huì)對(duì)最終結(jié)果的可靠性有影響。 2. 凝膠質(zhì)量。不連續(xù)SDS-PAGE膠對(duì)凝膠的要求較高，分離膠的PH值應(yīng)在8.8左右，而濃縮膠的PH應(yīng)在6.8左右，最好不要差過(guò)0.5個(gè)PH單位，因?yàn)檫@個(gè)PH條件是保證電泳液中的甘氨酸不電離的必要條件，也是保證能充分壓縮樣品的前提。因此，制備凝膠的時(shí)候所用Tris-HCl緩沖液的PH值是否穩(wěn)定是很重要的。 3. 點(diǎn)樣。樣品盡量不要與電泳液混合，這樣能提高濃縮的效果，因?yàn)殡娪疽篜H值為8.3，而樣品為7.5，混合后會(huì)影響到樣品的PH值，進(jìn)而影響濃縮效果。因此，建議點(diǎn)樣最好用長(zhǎng)槍頭，或者加樣器，輕輕的將樣品加到孔的底部。 4. 電泳緩沖液。盡量用新鮮配制的。這樣能保證PH值和離子強(qiáng)度的穩(wěn)定。 5. 電壓條件。我們經(jīng)常用的濃縮時(shí)80V，分離時(shí)100V比較好，條帶很平。 6. 轉(zhuǎn)膜。膜的選擇主要從實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)要求來(lái)考慮。例如，要做分子量小于20kD的小蛋白，0.45μm的NC膜是不可取的，因?yàn)檫@樣可能會(huì)使得蛋白因透過(guò)膜孔而造成膜結(jié)合的目的蛋白量不確定，從而影響到最終結(jié)果的可靠性。而如果所分離的蛋白需要進(jìn)行測(cè)序，則非PVDF膜不可，因?yàn)橹挥蠵VDF膜才能經(jīng)受住嚴(yán)酷的清洗條件。 7. 抗體雜交與底物顯色。一抗盡量選擇小鼠或者兔來(lái)源的單克隆抗體，還有要注意所用的抗體是否能夠識(shí)別變性條件下的目標(biāo)蛋白；二抗一般都是效價(jià)很高的，只要室溫下雜交1小時(shí)就可以了，適當(dāng)延長(zhǎng)也是可以的。另外，要選擇靈敏度較高的化學(xué)反應(yīng)底物。如超敏型ECL發(fā)光液Enlight-Plus，檢測(cè)級(jí)別可達(dá)pg級(jí)，發(fā)光時(shí)間長(zhǎng)，穩(wěn)定。 |
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