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siRNA轉(zhuǎn)染過程中常見問題及解答
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問：siRNA導入細胞有哪些方法，哪種最好？ 答：siRNA導入細胞有以下幾種方法：化學轉(zhuǎn)染技術、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀技術、顯微注射和載體導入技術。選擇時應該依據(jù)實驗條件考慮以下因素：細胞對轉(zhuǎn)入方式的承受能力、細胞對病毒侵染的易感性、細胞的生長特性等。對貼壁細胞來說化學轉(zhuǎn)染技術是最為常用的方法，而對懸浮細胞則采用電穿孔法效果較好。 問：哪種轉(zhuǎn)染試劑效果好？ 答：在選擇轉(zhuǎn)染試劑時，一般要考慮的是特定的細胞株，而不是被導入細胞中的物質(zhì)。脂質(zhì)體試劑的毒性較大，建議選擇非脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑，如Entranster系列試劑。 問：如何篩選轉(zhuǎn)染試劑？ 答：好的轉(zhuǎn)染試劑有以下特點：1、對siRNA有較高的轉(zhuǎn)染率；2、對細胞的毒性小。在mRNA水平檢測siRNA導入的效果比用看家基因的siRNA陽性對照檢測更為準確。 問：在轉(zhuǎn)染時我發(fā)現(xiàn)有不少細胞死亡，應該如何處理？ 答：轉(zhuǎn)染后大多數(shù)細胞死亡表明：轉(zhuǎn)染條件需要進一步地優(yōu)化。在優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件時需要考慮以下因素：轉(zhuǎn)染試劑和細胞特有的自身條件。例如：siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的比例、轉(zhuǎn)染時間、細胞傳代數(shù)和細胞密度等。 問：對于難轉(zhuǎn)染的細胞，應該如何提高其轉(zhuǎn)染效率？轉(zhuǎn)染效率又該如何確定？ 答：對于難轉(zhuǎn)染的細胞的轉(zhuǎn)染，如何提高轉(zhuǎn)染效率的問題也是目前研究的技術難題。一般建議使用電轉(zhuǎn)的方法，但是由于電轉(zhuǎn)的方法對細胞損傷比較大，該方法也未必是最佳的。轉(zhuǎn)染效率的確定，常用的是使用熒光標記的siRNA，通過熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡，流式細胞儀檢測的方法。 問：轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)細胞死亡是什么原因？如何優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件？ 答：轉(zhuǎn)染后細胞死亡，原因也是多樣的，如脂質(zhì)體毒性，轉(zhuǎn)染濃度過高，轉(zhuǎn)染前的細胞狀態(tài)不佳等都可能導致轉(zhuǎn)染后細胞死亡的情況發(fā)生，這種情況下就需要適當優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件；可以選擇細胞毒性小的非脂質(zhì)體類的轉(zhuǎn)染試劑，如Entranster試劑，另外，如果siRNA所靶向的基因?qū)τ诰S持細胞生長是非常重要的，出現(xiàn)細胞死亡的現(xiàn)象可能正是由于基因干擾引起的，如果由于細胞死亡而影響檢測的話，可以適當調(diào)整檢測時間。實驗條件的優(yōu)化，包括轉(zhuǎn)染前細胞密度調(diào)整，轉(zhuǎn)染濃度，檢測時間等。 |
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