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[求助]
線粒體自噬指示工具-mt-Keima質(zhì)粒DMSO和自噬誘導(dǎo)組完全拍攝不到綠色熒光，求助！
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求助！ 問(wèn)題背景是：我們實(shí)驗(yàn)室從別的實(shí)驗(yàn)室要了mt-Keima的質(zhì)粒（mt-keima在線粒體自噬發(fā)生的時(shí)候(pH=4)，激發(fā)光在561左右nm發(fā)出來(lái)的光為紅色，在靜息狀態(tài)下(pH=4)，激發(fā)光在458nm左右呈綠色），但是我兩次瞬轉(zhuǎn)293，無(wú)論DMSO還是線粒體自噬誘導(dǎo)劑CCCP處理均只能拍到紅色熒光，而綠色熒光拍不到，用的是蔡司的共聚焦顯微鏡。第一次做的時(shí)候用458nm和561nm的激發(fā)光，發(fā)射光信號(hào)采集范圍由軟件本身smart setup決定，拍攝不到綠色熒光；第二次做的時(shí)候詢問(wèn)了贈(zèng)予我們質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)師兄，他說(shuō)都用561nm的激發(fā)光，綠色和紅色信號(hào)選擇采集發(fā)射光范圍不同即可，同時(shí)他們用的是徠卡的共聚焦，需要用到between frame模式。 我的問(wèn)題是：1，看了些應(yīng)用mt-Keima的文獻(xiàn)，綠色和紅色分別用的是不同的激發(fā)光，我用同一個(gè)激發(fā)光拍出來(lái)的，紅色和綠色信號(hào)完全重疊，所以一個(gè)激發(fā)光完全行不通呀，到底應(yīng)該選擇什么激發(fā)光？detection的波長(zhǎng)采集區(qū)域需要設(shè)置為多少范圍呢？ 2. between frame 在蔡司的共聚焦上有嗎，這個(gè)功能我百度了之后我覺(jué)得對(duì)于我拍照的影響不打，覺(jué)得不相關(guān)。這個(gè)功能可能對(duì)我的實(shí)驗(yàn)有影響嗎？ 3. 關(guān)于mt-keima質(zhì)粒本身，是不是這個(gè)質(zhì)粒就可能有問(wèn)題，這個(gè)質(zhì)粒按照贈(zèng)予我們質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)室發(fā)表文章中引用的一篇參考文獻(xiàn)來(lái)看（PMID:21867919）需要提前一天用ponasteronae A處理以誘導(dǎo)mt-Keima的表達(dá)，但其他文獻(xiàn)中均沒(méi)有看到這個(gè)說(shuō)法例如在PMID:28703790中。 所以求助各位大佬們，拜托幫我想想問(wèn)題出在哪了，為什么我拍不出來(lái)綠色熒光信號(hào)呢？下面的兩張圖是通過(guò)手機(jī)在目鏡上拍的，但是共聚焦就拍不出來(lái)，且下面的圖片是我DMSO組，按理說(shuō)不應(yīng)有紅色信號(hào)。 微信圖片_20210619144423.jpg 微信圖片_20210619144429.jpg |
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