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夏夏Dana新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
PCR擴(kuò)增一直失敗 已有1人參與
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1、篩選到的菌株，NCBI鑒定菌種類(lèi)型，最大相似度到達(dá)92%，查找目的基因根據(jù)ORF框設(shè)計(jì)引物，目標(biāo)片段1400多bp，一直擴(kuò)增不出來(lái)。 2、一個(gè)菌株中，編碼同一個(gè)酶的基因有三種，僅擴(kuò)增出一個(gè)，另外兩個(gè)一直擴(kuò)增失敗。 請(qǐng)問(wèn)如何優(yōu)化? |
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夏夏Dana
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 13
- 帖子: 7
- 在線: 2.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 14862102
- 注冊(cè): 2019-04-12
- 專(zhuān)業(yè): 生物化學(xué)
6樓2019-10-25 14:57:20
woshishui916
木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 15 (小學(xué)生)
- 金幣: 8212.4
- 散金: 70
- 紅花: 3
- 帖子: 1800
- 在線: 301.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 335922
- 注冊(cè): 2007-03-31
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 植物遺傳學(xué)
2樓2019-10-21 21:15:12
3樓2019-10-22 14:34:16
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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樓主你好，根據(jù)你的描述，我建議你首先檢查引物。 可以使用NCBI的primer-BLAST來(lái)評(píng)價(jià)你設(shè)計(jì)的引物是否足夠好。 如果引物的特異性沒(méi)有問(wèn)題，并且不存在形成引物二聚體的問(wèn)題，那么你需要考慮你是否使用了適合你引物的退火溫度。 一對(duì)好的引物，它們的Tm相差不大于5，并且GC含量相似（如果你加了限制性酶切位點(diǎn)，也要考慮進(jìn)去）。一般的退火溫度是引物的Tm－5。 其次，你還需要檢查延伸時(shí)間。根據(jù)不同的聚合酶，它們的擴(kuò)增速度不同，你需要根據(jù)你的目的片段的長(zhǎng)度調(diào)整延伸時(shí)間。以上兩點(diǎn)可以參考你使用的聚合酶說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行調(diào)整。 如果你有陽(yáng)性對(duì)照的話（即提取自你BLAST匹配到的菌種的DNA），還可以試著做一個(gè)溫度梯度PCR，來(lái)測(cè)試不同的退火溫度，選擇其中更適合你的引物的條件。 此外，你說(shuō)到“編碼同一個(gè)酶的基因有三種，僅擴(kuò)增出一個(gè)”，意思是同一個(gè)物種當(dāng)中有三個(gè)等位基因？ 它們的CDS序列兩端一樣嗎？如果不一樣需要根據(jù)不同的基因設(shè)計(jì)不同的引物。 預(yù)祝你成功。  有問(wèn)題歡迎繼續(xù)交流 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
夏夏Dana
4樓2019-10-23 20:01:55
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