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MAS_rice至尊木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[求助]
構(gòu)建pET29a原核表達(dá)載體 已有1人參與
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構(gòu)建pET29a原核表達(dá)載體時(shí)，只需要構(gòu)建目的基因和6×his的融合蛋白，因此用Nde1和Xho1把S-tag和thrombin site也切掉了，通過(guò)同源重組把目的基因重組到pET29a，這時(shí)候表達(dá)蛋白就多了一個(gè)ATG，相當(dāng)于表達(dá)蛋白開(kāi)始有兩個(gè)甲硫氨酸，但是如果構(gòu)載體時(shí)把ATG去掉，那么正確的蛋白就只有一個(gè)Met，所以，請(qǐng)問(wèn)是否需要去掉ATG，還是融合蛋白多一個(gè)Met沒(méi)有關(guān)系呢？ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
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snoopyzxx
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西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2019-06-06 07:50:23
西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2019-06-06 07:50:23
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樓主是用的Gibson克隆嗎？如果是，設(shè)計(jì)引物的時(shí)候不要目的基因的第一個(gè)密碼子，從第二個(gè)密碼子開(kāi)始擴(kuò)增。另一個(gè)疑問(wèn)，如果是用Nde I酶切載體，理論上是不存在ATG了啊，因?yàn)槟闶怯玫闹亟M克隆方式，而不是酶切連接方式。所以需要好好看看你的設(shè)計(jì)。另，樓主能不能把這個(gè)載體送給我？或者跟我換一個(gè)？ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
4樓2019-06-04 22:18:48
wuhu0612331
銅蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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2樓2019-06-03 15:35:32
MAS_rice
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3樓2019-06-03 16:16:33
MAS_rice
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Infusion 重組，設(shè)計(jì)引物的時(shí)候重新生成了酶切位點(diǎn)，我去掉了片段上的第一個(gè)ATG，因此表達(dá)蛋白從第一個(gè)Met開(kāi)始的，后面6xhis融合表達(dá)正確。其次，大家都說(shuō)前面多一個(gè)Met是沒(méi)有關(guān)系的，但是我還是去掉了。質(zhì)粒我們可以交換啊  發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
5樓2019-06-05 01:23:36
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