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[求助]
基因敲除實驗求助 已有1人參與
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基因敲除實驗求助，本人正在做假單胞菌株基因的敲除，利用同源重組的原理構(gòu)建了上下游同源臂，載體為自殺質(zhì)粒含SacB基因?qū)φ崽敲舾�，已重新�?gòu)建目的基因上下游至自殺質(zhì)粒中，利用接合轉(zhuǎn)移或是電轉(zhuǎn)方法在雙抗板上篩選出野生菌攜帶重組質(zhì)粒。 目的基因是耐藥基因，野生菌株是假單胞菌（含有4ug/ml美羅抗性，在10ug/ml四環(huán)素也能長，超過20ug/ml四環(huán)素不長），使用的自殺質(zhì)粒是含有SacB基因的pEX18Tc（含有四環(huán)素抗性），在單交換這一步嘗試過接合轉(zhuǎn)移，也嘗試過電轉(zhuǎn)，有時能在雙抗板上長出單克隆，有時不能；有一次電轉(zhuǎn)后將雙抗板（20ug/ml四環(huán)素+4ug/ml美羅）上的出現(xiàn)單克隆進(jìn)行之字劃線后做PCR，概率是120個中出現(xiàn)了2個SacB陽性條帶和野生株特異基因條帶，將陽性的之字劃線再去密涂保種方便后續(xù)用蔗糖平板篩選出雙交換，但是將密涂保種的菌進(jìn)行PCR時，SacB陽性條帶已經(jīng)消失了，再去取之字上的菌做PCR時，SacB基因陽性條帶也消失了，求助各位大神想知道這是什么原因，為什么出現(xiàn)條帶后又消失了，如果正確的話我應(yīng)該如何將陽性條帶進(jìn)行保種，好不容易出現(xiàn)一次SacB陽性，已經(jīng)很久沒做出這個實驗了，我應(yīng)該如何得到單交換菌株？？求助各位大佬們有空時解答！��！ 還有一個問題得到單交換菌株后，用無抗性液體培養(yǎng)后稀釋1000倍再涂布蔗糖平板，再利用原始野生株包含目的基因上下游片段進(jìn)行PCR，若敲除成功，則擴(kuò)增條帶將缺少目的基因?qū)?yīng)的長度。嘗試在10%的蔗糖和15%蔗糖平板上涂布了，37℃溫箱培養(yǎng)了18h，再挑取很多個單克隆做的PCR，還是沒結(jié)果，是否蔗糖平板在37℃溫箱培養(yǎng)時間要延長？？求助各位大佬們有空時解答�。�！ |
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清醒的瞌睡蟲
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3樓2025-05-22 16:28:24
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