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Squama新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助，用CRISPR-Cas9一直敲不掉鮑曼的基因 已有2人參與
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CRISPR的實驗已經(jīng)開展了兩個多月了，一直篩不出成功敲除的目標(biāo)菌，快崩潰了 。參考的文章是CellPress的CRISPR-Cas9-Based Genome Editing and Cytidine Base Editing in Acinetobacter baumannii 一切按照說明書來，唯一的不同可能是我們把供體片段連接到pSGAb上了，因為擔(dān)心供體和質(zhì)粒一起電轉(zhuǎn)效率不高。 在每一步質(zhì)粒操作前都PCR驗證過質(zhì)粒上的關(guān)鍵片段，比如cas表達(dá)基因、RecAb重組酶表達(dá)基因、gRNA和供體片段，而且也經(jīng)過測序證明序列沒有問題。在幾次重復(fù)的時候也更換過IPTG、更換過藥板，也嘗試延長誘導(dǎo)時間，但最后還是沒有陽性菌。 篩選的時候一開始400ul電轉(zhuǎn)完的菌液只取100ul來涂雙抗板，后來無論是全部菌液涂幾塊板，挑96個，還是濃縮菌液后涂一個板然后調(diào)所有菌落（也長的不多，只有40~50個左右菌落），都沒有篩出來陽性菌。 目前比較迷惑的問題： 1.是文章里寫成果經(jīng)過供體同源重組的話能產(chǎn)生一百多個菌落，但是我們的試驗好幾次都只有不到100個菌落，而且和兩個對照（不把供體導(dǎo)入和只導(dǎo)入個原質(zhì)粒）長出來的菌落數(shù)差不多，這是說明同源重組沒有成功還是cas9沒有切斷目的位點(diǎn)？。 2.篩選的雙抗板上長的菌長速明顯有差異，有些菌落長得很快，養(yǎng)個過夜就有綠豆大小的菌落，有些又幾乎養(yǎng)個48小時才長出來個針尖狀的小菌落，但是檢驗過這些無論大的小的都是鮑曼，是什么原因？ 3.供體片段是不是不能連在pSGAb上一起轉(zhuǎn)？是不是按照文章里面寫的用單鏈供體片段和質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)進(jìn)去比較好？用不對稱PCR來獲取單鏈供體片段可行嗎？ 希望有經(jīng)驗的兄弟指導(dǎo)指導(dǎo)，謝謝�。�！ |
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2樓2022-05-28 19:51:07
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3樓2022-06-14 08:44:55
wangzh123
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【答案】應(yīng)助回帖
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樓主你好，我之前用過中科院楊晟老師開發(fā)的CRISPR/Cas系統(tǒng)做基因敲除。 關(guān)于你的第一個問題，我覺得只要板子上長出單克隆就行，不必追求單克隆的數(shù)目。因為不同的細(xì)菌種類，感受態(tài)濃度，電擊條件等等都會影響最后長出的單克隆數(shù)目。 關(guān)于你的第二個問題，可能是因為單克隆之間的差異造成的。 關(guān)于你的第三個問題，我之前試過donor片段和sgRNA質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)，也試過將donor片段構(gòu)建到sgRNA的質(zhì)粒上再進(jìn)行電轉(zhuǎn)。我實驗下來，感覺后面的方法效率更高，而且更加精確。 希望我的回答能夠?qū)δ阌袔椭�。rockwzh@163.com，這是我的郵箱，之后再有問題，可以再交流。 |
4樓2022-06-28 11:29:06
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