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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 藥學 » 藥代動力學 » 體外肝微粒體代謝問題
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| 【懸賞金幣】回答本帖問題，作者長夏123將贈送您 50 個金幣 | ||
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體外肝微粒體代謝問題
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 我進行體外肝微粒體孵育實驗，加入相應底物 代謝后體系中一直檢測不到代謝產(chǎn)物，我該怎么辦，與沒有做過的前輩指導一下 我的體系是這樣配制的 0.1MTris-Hcl緩沖液 ：稱取Tris3.03g加入150ml新沸冷水溶解，加濃HCL調PH至7.4,新沸冷水定容到250ml搖勻 1%的NaHCO3溶液：精密稱取NaHCO3100mg，置于10ml容量瓶，加水溶解并稀釋至刻度定容 0.15M MgCl2 溶液的制備：取2.86gMgcl2,加水溶解定容至200ml 啟動子溶液(0.5ML體系)：稱取NADP 10Mg，NADPH 5Mg置于同一EP管，加入0.5ml 1%的NaHCO3分裝.放到－20保存，使用時放到冰上融化。 配制過程冰浴。 NADPH再生系統(tǒng)溶液（10ml體系）：一水檸檬酸28.55mg，異檸檬酸脫氫酶1.38ml，于小燒杯加0.15M Mgcl2溶液 0.95ml, 0.1M Tris-HCL 溶液9.05ml溶解。配制過程冰浴。完成后每1ml分裝于1.5mlEP管中，約10管。置于-20°冰箱保存。用時解凍后使用。因為購買不到枸櫞酸脫氫酶所以用異檸檬酸脫氫酶進行代替,體系不反應是這里出現(xiàn)問題了嗎？ 終止液：3mg氯雷他定溶于1ml乙腈 ，取100ul加入9.9ml乙腈。得30ng/ml得氯雷他定乙腈溶液10ML。每1ml分裝于1.5EP管分10管。 －２０°Ｃ 儲 存 1.5EP管中加NADPH再生系統(tǒng)189μL，人肝微粒體5μL（人微粒體蛋白終濃度0.5 mg/ml），加入1A2探針底物10000μM非那西汀溶液1μL，渦旋混勻1min。經(jīng)37℃水浴 預孵育5 min后，加入啟動子溶液5μL啟動反應渦旋混勻1min，繼續(xù)水浴 孵育20min。加入冰冷的乙腈400μL（含內(nèi)標氯雷他定）終止反應。渦旋振蕩3min， 13000rpm離心15min沉淀蛋白，取上清液后液相測定，底物減少的量,代謝產(chǎn)物生成量。平行做三組. 有人指導一下嗎，因為實驗室就我自己也沒有任何人指導都是自己摸索，也不知道哪里不對，求前輩們指導一下 |
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lilisky1214
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