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[交流]
Red同源重組，大腸桿菌EDL933同源重組效率低是什么原因��？
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 萌新最近開始做Red同源重組來敲除大腸桿菌O157(EDL933)中的一個基因，我用的是pKD4 pKD46 pCP20這三個質粒，從DH5a中提取出來就PCR驗證了，證明質粒沒有問題，現(xiàn)在已經(jīng)得到了pKD46/O157重組子，下一步就是打靶片段擴增，我的打靶片段是選取目的基因上下游50bp同源，然后以pKD4為模板擴增含有Kan抗性的打靶片段，L-阿拉伯糖終濃度是30mM，誘導2h，再用10%甘油處理做成電轉感受態(tài)，電轉條件是2.5kv,5ms。加入1ml LB 30℃孵育2h，之后離心涂布到Kan抗性平板，設置了陰性對照（電轉水）、陽性對照（電轉pKD4），打靶片段還用Dpn 1處理了，但是實驗組和對照組都沒有長。我懷疑是這樣幾個原因： 1.電轉感受態(tài)制備活性不夠好 2.打靶片段擴增出現(xiàn)錯配（我沒有測序，是PCR產(chǎn)物用Dpn 1酶處理再跑膠切膠回收） 3.是不是同源替換片段太長了，我打靶片段是1598bp，然后目的基因是699bp，會不會是太長了同源重組難以發(fā)生？ 4.我?guī)熜终f現(xiàn)在第一步就是把陽性對照弄出來，但是陽性對照我看了pKD4和pKD46沒有相同的啟動子，應該是可以共存的，那就是說明我電轉化感受態(tài)制備有問題？ 5.還有個問題就是我怎么判斷pKD46被誘導表達了同源重組酶？ 想請教下各位分子大佬，有沒有做這方面的經(jīng)驗，能對小弟我指導下，而且網(wǎng)上查還說大腸桿菌K系列什么的容易敲除，這個什么系列是怎么查看的呢？ |
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9樓2019-12-03 19:50:10
★
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
|
可能是打靶DNA片段濃度太低，導致重組效率低�？梢越档蚿KD 4擴增時的模板濃度，不用DpnI處理，另外，你的電擊電壓太大，導致致死率偏高 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2019-12-03 11:53:27
8樓2019-12-03 17:27:22
10樓2019-12-03 19:52:30
簡單回復
2019-12-03 13:06
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2019-12-03 13:20
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2019-12-03 13:31
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biosci7樓
2019-12-03 17:26
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寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
j 發(fā)自小木蟲Android客戶端
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