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draxlx新蟲 (小有名氣)
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[求助]
構(gòu)建且成功表達過的重組質(zhì)粒 復(fù)測數(shù)據(jù)時不表達了 已有1人參與
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各位大佬，誠心求助。 4月份的時候，我用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建了一個 "目的基因+耐熱基因+表達載體" 的重組質(zhì)粒 ，成功表達了“目的基因+耐熱基因”的融合蛋白，測其酶學(xué)特性顯示 ：融合蛋白比野生酶在溫度穩(wěn)定性方面有了極大改善。 現(xiàn)在7月份，我用當(dāng)初保藏的菌種 再次擴培、破胞、純化，復(fù)測其溫度穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)與野生酶一樣，重復(fù)不出當(dāng)初的數(shù)據(jù)。 跑過菌液電泳，確實是重組質(zhì)粒的菌液沒有拿錯。 又跑了蛋白膠，結(jié)果沒有融合蛋白的表達條帶，反而有野生酶的表達條帶。（怪不得復(fù)測的時候，融合蛋白與野生酶的數(shù)據(jù)幾乎一模一樣，差別十分微小） 有沒有朋友出現(xiàn)過這種情況��？ （4月份所測的數(shù)據(jù)是沒有錯的，因為當(dāng)時短時間內(nèi)有3個人都測了，三個人測出來的數(shù)據(jù)是高度統(tǒng)一的。） |
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6樓2022-07-31 14:21:01
2樓2022-07-29 13:03:58
pennchem
專家顧問 (正式寫手)
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- 注冊: 2012-11-21
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
- 管轄: 生物科學(xué)
3樓2022-07-29 16:46:09
draxlx
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 192
- 散金: 20
- 帖子: 63
- 在線: 2.5小時
- 蟲號: 29159617
- 注冊: 2022-03-15
- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
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謝謝您的回答。 已經(jīng)試過將當(dāng)初保存的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化后表達，蛋白膠結(jié)果顯示有融合蛋白條帶出現(xiàn)，但是表達量非常小，且依舊有本不該出現(xiàn)的野生酶表達條帶。 現(xiàn)在準備重新再構(gòu)建一次質(zhì)粒試試。 菌液電泳跑的是質(zhì)粒電泳。我現(xiàn)在不明白的主要是 為什么野生酶依舊有表達呢，當(dāng)初構(gòu)建重組質(zhì)粒的時候用的是無縫克隆，終止密碼子、酶切位點等全都去掉了，將兩個基因“無縫”地連在一起，如果是蛋白表達有問題，那也應(yīng)該是全部不表達。 |
4樓2022-07-31 13:39:34
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