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labinnah金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
AKK菌粉復(fù)蘇培養(yǎng) 已有2人參與
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第一次做菌種復(fù)蘇，還是厭氧菌，完全小白一個(gè)。 買(mǎi)的CICC的akk菌（相較于ATCC的便宜），按說(shuō)明書(shū)要求配制了巧克力血平板，同時(shí)也按照部分文獻(xiàn)參數(shù)配制了含L-蘇氨酸及N-乙酰-D-氨基葡萄糖的改良BHI液體培養(yǎng)基。將菌粉用無(wú)菌生理鹽水溶解后，各板/管加入50或100 uL菌液，平板涂布、試管混勻后分兩批，分別放入37℃厭氧產(chǎn)氣袋或厭氧培養(yǎng)箱中，到現(xiàn)在48h，只有一管BHI液體明顯渾濁，還有飄絮一樣的物質(zhì)。其余未見(jiàn)菌生長(zhǎng)  想請(qǐng)教大家： 1.菌粉凍干管之前一直按說(shuō)明書(shū)要求4℃保存，但距現(xiàn)在使用時(shí)已有3個(gè)多月，菌是否可能已死亡？ 2.說(shuō)明書(shū)提示要用巧克力平板復(fù)蘇，按配方溶解瓊脂滅菌后，80-90℃加入無(wú)菌脫纖維羊血，繼續(xù)酒精燈上搖勻5min左右，但發(fā)現(xiàn)瓊脂內(nèi)部還是存在細(xì)微的血凝塊樣物質(zhì)（直徑≤1mm），不像有些巧克力血平板那樣質(zhì)地均勻，這個(gè)巧克力血平板是不是做翻車(chē)了？做了2批都是這樣 3.目前巧克力血平板表面未見(jiàn)菌落，但不知道有沒(méi)有菌膜生成，背景色太深看不清楚。操作時(shí)加的50或100uL菌是不是太多了？導(dǎo)致沒(méi)有單個(gè)菌落生成 4.說(shuō)明書(shū)對(duì)時(shí)間說(shuō)明有點(diǎn)籠統(tǒng)，只提到“菌種常規(guī)培養(yǎng)時(shí)間：細(xì)菌1-2天，酵母3天，霉菌5-7天，大型真菌 7-10天”，并未細(xì)化。看到文獻(xiàn)提到用BHI培養(yǎng)基復(fù)蘇三至七天的都有，我目前培養(yǎng)時(shí)間48h是不是短了，得繼續(xù)等等看？但是萬(wàn)一等到7天都沒(méi)有是不是就實(shí)錘翻車(chē)了？ 5.唯一的BHI渾濁飄絮可能是污染嗎？ 先謝過(guò)各路大佬了，求大佬翻牌，謝謝  |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
labinnah: 金幣+200, ★★★★★最佳答案 2022-04-15 22:39:30
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買(mǎi)的CICC的akk菌（相較于ATCC的便宜），按說(shuō)明書(shū)要求配制了巧克力血平板，同時(shí)也按照部分文獻(xiàn)參數(shù)配制了含L-蘇氨酸及N-乙酰-D-氨基葡萄糖的改良BHI液體培養(yǎng)基。 /CICC的菌種還是比較靠譜的，培養(yǎng)基推薦用 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(FT)，試劑商有成品銷(xiāo)售。剛開(kāi)始不建議養(yǎng)這么難養(yǎng)的厭氧菌，先用金葡或者大腸練練手。 將菌粉用無(wú)菌生理鹽水溶解后，各板/管加入50或100 uL菌液，平板涂布、試管混勻后分兩批，分別放入37℃厭氧產(chǎn)氣袋或厭氧培養(yǎng)箱中，到現(xiàn)在48h， /AKK是嚴(yán)苛厭氧菌，所有接觸的水溶液最好都做驅(qū)氧處理，溶解氧會(huì)殺死菌株 只有一管BHI液體明顯渾濁，還有飄絮一樣的物質(zhì)。其余未見(jiàn)菌生長(zhǎng) /是否污染需要檢測(cè)，從培養(yǎng)時(shí)間上看不會(huì)是真菌污染，可以取部分菌液出來(lái)，反正非厭氧環(huán)境中觀察菌是否會(huì)繼續(xù)增殖或者死亡。 想請(qǐng)教大家： 1.菌粉凍干管之前一直按說(shuō)明書(shū)要求4℃保存，但距現(xiàn)在使用時(shí)已有3個(gè)多月，菌是否可能已死亡？ /凍干粉狀態(tài)可以保存很久，十年八年死不了。 2.說(shuō)明書(shū)提示要用巧克力平板復(fù)蘇，按配方溶解瓊脂滅菌后，80-90℃加入無(wú)菌脫纖維羊血，繼續(xù)酒精燈上搖勻5min左右，但發(fā)現(xiàn)瓊脂內(nèi)部還是存在細(xì)微的血凝塊樣物質(zhì)（直徑≤1mm），不像有些巧克力血平板那樣質(zhì)地均勻，這個(gè)巧克力血平板是不是做翻車(chē)了？做了2批都是這樣 /血平板可以找試劑商購(gòu)買(mǎi)成品的，便宜還質(zhì)量可靠，比自己做劃算 3.目前巧克力血平板表面未見(jiàn)菌落，但不知道有沒(méi)有菌膜生成，背景色太深看不清楚。操作時(shí)加的50或100uL菌是不是太多了？導(dǎo)致沒(méi)有單個(gè)菌落生成 /涂布的話很難有單菌落生成，如果為了純化，請(qǐng)劃線來(lái)獲得單菌落。 4.說(shuō)明書(shū)對(duì)時(shí)間說(shuō)明有點(diǎn)籠統(tǒng)，只提到“菌種常規(guī)培養(yǎng)時(shí)間：細(xì)菌1-2天，酵母3天，霉菌5-7天，大型真菌 7-10天”，并未細(xì)化�？吹轿墨I(xiàn)提到用BHI培養(yǎng)基復(fù)蘇三至七天的都有，我目前培養(yǎng)時(shí)間48h是不是短了，得繼續(xù)等等看？但是萬(wàn)一等到7天都沒(méi)有是不是就實(shí)錘翻車(chē)了？ /AKK是細(xì)菌，正常48小時(shí)就長(zhǎng)好了，除非生長(zhǎng)條件不合適�？梢栽俚鹊� 5.唯一的BHI渾濁飄絮可能是污染嗎？ /是否污染需要檢測(cè)，從培養(yǎng)時(shí)間上看不會(huì)是真菌污染，可以取部分菌液出來(lái)，反正非厭氧環(huán)境中觀察菌是否會(huì)繼續(xù)增殖或者死亡。 |
labinnah4樓2022-04-15 14:57:58
testobio
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2樓2022-04-15 14:22:08
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做下鏡檢對(duì)比一下，菌株形態(tài)，或者送檢16s測(cè)序 https://www.jcm.riken.jp/cgi-bin ... amp;CN=&DN= |
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3樓2022-04-15 14:28:58
labinnah
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5樓2022-04-15 22:35:01
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