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victor_u新蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
利用凝膠過(guò)濾層析純化蛋白質(zhì)的前期準(zhǔn)備 已有8人參與
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凝膠過(guò)濾層析是利用具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的顆粒的分子篩作用，根據(jù)被分離樣品中各組分相對(duì)分子質(zhì)量大小的差異進(jìn)行洗脫分離的一項(xiàng)技術(shù)。 凝膠過(guò)濾層析（gel filtration chromatography）法又稱為排阻層析或分子篩方法，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類物質(zhì)，使蛋白質(zhì)混合物中的物質(zhì)按分子大小的不同進(jìn)行分離。也叫做分子排阻層析（molecular-exclusion chromatography）。一種利用帶孔凝膠珠作基質(zhì)，按照分子大小分離蛋白質(zhì)或其它分子混合物的層析技術(shù)。 一般是大分子先流出來(lái)，小分子后流出來(lái)。凝膠過(guò)濾層析非常適合對(duì)pH變化、金屬離子或輔助因子濃度以及大環(huán)境情況敏感的生物分子。 為了進(jìn)行分離，將凝膠填料裝柱形成柱床。填料是球狀顆粒的多孔填料，根據(jù)其化學(xué)和物理穩(wěn)定性以及惰性（沒(méi)有反應(yīng)性和吸附性）進(jìn)行的選擇。在分離過(guò)程中，樣品用同溶劑進(jìn)行洗脫，而在分離的后期，通常需要使用流動(dòng)的緩沖液，以便移除柱子中殘余的分子，使柱子可用于下一次分離。 樣品制備 樣品必須澄清，沒(méi)有顆粒狀物。 樣品緩沖液：樣品緩沖液的pH、離子強(qiáng)度和組成不會(huì)顯著性影響結(jié)果的分辨率，只要這些參數(shù)不影響被分離蛋白質(zhì)的大小和穩(wěn)定性，也不超出填料的穩(wěn)定范圍。 樣品濃度：凝膠過(guò)濾與樣品質(zhì)量無(wú)關(guān)，因此與樣品濃度也沒(méi)有關(guān)系。通常不要超過(guò)70 mg/mL蛋白濃度。樣品的溶解性和粘度會(huì)限制樣品濃度，關(guān)鍵在于樣品相對(duì)于流動(dòng)相的粘度，太高的樣品粘度會(huì)引起分離的不穩(wěn)定性和不規(guī)則的流動(dòng)形式，這回導(dǎo)致非常寬和成串的峰形，反壓也會(huì)增加。 樣品體積：在凝膠過(guò)濾中，這是最重要的參數(shù)之一。 緩沖液組成和制備 在凝膠過(guò)濾中，緩沖液的組成不直接影響獲得的分辨率，更重要的考慮是，緩沖液對(duì)目標(biāo)蛋白分子的形狀和生物學(xué)活性的影響。選擇的緩沖液和pH需要使蛋白保持穩(wěn)定性和活性，并且目的蛋白在其中能夠收集。 注意在使用之前，緩沖液應(yīng)當(dāng)使用0.45微米或者0.22微米的膜進(jìn)行過(guò)濾，在進(jìn)行凝膠過(guò)濾之前，必須去除緩沖液中的氣體。 而在凝膠過(guò)濾層析中，柱效尤為重要。由于分離過(guò)程中只有一個(gè)柱體積的緩沖液流過(guò)柱子，裝柱柱床和顆粒的均一性影響流過(guò)柱子的一致性，因此影響峰形和最終的峰寬。高度均一的凝膠過(guò)濾填料有助于分子的窄峰洗脫。因此要尤為注意所用柱子的柱效。 做完準(zhǔn)備工作后，就可以用 Union蛋白純化儀 進(jìn)行樣品純化了。 |
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