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shnmyx

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求助構(gòu)建shRNA敲除載體遇到問(wèn)題: 領(lǐng)取紅包 (小木蟲(chóng)手機(jī)app專屬紅包)

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本人第一次做分子實(shí)驗(yàn)，從設(shè)計(jì)shRNA，構(gòu)建shRNA敲除載體開(kāi)始，現(xiàn)在已經(jīng)構(gòu)建好，開(kāi)始驗(yàn)證是否構(gòu)建正確，遇到如下問(wèn)題，想請(qǐng)教路過(guò)的各位大神，謝謝。
問(wèn)題1: 將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從同一個(gè)板上挑了三個(gè)轉(zhuǎn)化子搖菌，分別提取質(zhì)粒，經(jīng)跑膠驗(yàn)證質(zhì)粒是否提出來(lái)，大小是否一致，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個(gè)質(zhì)粒不是同一個(gè)大小，有人遇到過(guò)這種情況嗎？是什么原因呢？是我構(gòu)的質(zhì)粒有問(wèn)題還是這種本身就會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性克��？
問(wèn)題2：為了驗(yàn)證酶切空載質(zhì)�；厥者@一步是否正確，有人建議將酶切回收后的這段序列進(jìn)行轉(zhuǎn)化鋪板，如果板上不長(zhǎng)菌就說(shuō)明酶切空載這步是正確的，但是結(jié)果是長(zhǎng)了，我當(dāng)時(shí)覺(jué)得我的質(zhì)粒加多了，正常的別人質(zhì)粒濃度1000ng/ul，只加1ul，我當(dāng)時(shí)加了4ul，會(huì)不會(huì)部分沒(méi)有切成功，導(dǎo)致回收的片段中還有完整質(zhì)粒存在，這樣做能說(shuō)明質(zhì)粒沒(méi)切成功嗎？大家一般會(huì)這樣做來(lái)驗(yàn)證嗎？
問(wèn)題3：如果排除前面的問(wèn)題，我最后構(gòu)建的符合我要的發(fā)大小的質(zhì)粒，做了雙酶切驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)都是符合我的要求的，唯一就是問(wèn)題2中出現(xiàn)的問(wèn)題，如果沒(méi)長(zhǎng)就確定我構(gòu)建成功，但是現(xiàn)在長(zhǎng)了，是否證明我沒(méi)有構(gòu)建成功？

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引用回帖:

17樓: Originally posted by rohdy at 2019-08-17 10:54:43
提了質(zhì)粒酶切條帶大小正確的拿去測(cè)序就好了，沒(méi)必要做太多驗(yàn)證

老師不讓測(cè)序

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23樓2019-08-17 16:05:52

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weizhe349樓

2019-08-17 10:06 回復(fù)

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?W痕14樓

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hdchina20104樓

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pandongzi3樓

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wangyongyu13樓

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木鳥(niǎo)0015樓

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yuying042111樓

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