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garakutadoll

新蟲(chóng) (初入文壇)

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肺克基因敲除問(wèn)題: 領(lǐng)取紅包 (小木蟲(chóng)手機(jī)app專(zhuān)屬紅包)

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本人采用red重組敲除，目的片段750bp左右，先電轉(zhuǎn)入含四環(huán)素抗性的pKD46質(zhì)粒，然后用阿拉伯糖誘導(dǎo)重組酶表達(dá)后制作成感受態(tài)，電擊轉(zhuǎn)化入重組片段（含上下游同源臂各250bp，卡那霉素抗性基因作為插入片段，總長(zhǎng)2000bp），但是第二天平板上都沒(méi)有菌落生長(zhǎng)

考慮問(wèn)題：1.重組片段是不是太長(zhǎng)，與目的基因長(zhǎng)度相差太大導(dǎo)致重組失敗

2.電轉(zhuǎn)效率低，當(dāng)時(shí)電轉(zhuǎn)質(zhì)粒時(shí)只獲得一個(gè)克隆，可能是感受態(tài)制作不行？肺克莢膜很厚，離心的時(shí)候很難離到底，是否有解決方法？能否用固體培養(yǎng)基做阿拉伯糖的誘導(dǎo)？

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1樓 2021-09-03 12:42:15

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張小蛋

新蟲(chóng) (小有名氣)

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★
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

我敲除的是大腸桿菌，上下同源臂200多bp,篩選標(biāo)記也是卡納，整個(gè)重組片段4000bp左右，轉(zhuǎn)化完后長(zhǎng)了三十多個(gè)菌落，片段都敲上去了，但是發(fā)現(xiàn)好像完成的是單交換，野生型和重組片段都能檢測(cè)出來(lái)，也很是頭疼，估計(jì)你這個(gè)首先要解決的是電轉(zhuǎn)效率的問(wèn)題

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14樓2021-09-04 11:13:51

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秋土豆香2樓

2021-09-03 12:49 回復(fù)

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tzynew3樓

2021-09-03 12:50 回復(fù)

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Miya0074樓

2021-09-03 13:12 回復(fù)

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whiteheads5樓

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wyj9706樓

2021-09-03 13:33 回復(fù)

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南宮紫玉7樓

2021-09-03 13:33 回復(fù)

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muhong19828樓

2021-09-03 13:43 回復(fù)

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nono20099樓

2021-09-03 14:14 回復(fù)

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stylelife610樓

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Michael98911樓

2021-09-03 19:17 回復(fù)

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阿文52112樓

2021-09-03 22:02 回復(fù)

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張小蛋13樓

2021-09-04 11:10 回復(fù)

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